糖のカーボンのケミカルシフトは良く調べられており、既知の糖であればデータを比較することによって構造を推定できることが多い。書籍、Carbon-13 NMR Spectroscopy, E. Breitmaier, W. Voelter 著, VCH, にたくさんのデータが掲載されている。ここであげたsucroseの帰属も二糖の項に掲載されている。また、methyl-α-glucopyranoside と D-fructose の重ねあわせともほぼ一致する。ここでは帰属の手順を解説するモデルとしてsucroseを選んだが、実際の構造解析ではデータ集、過去の文献を活用してほしい。
ケミカルシフトの基準にはTSPを内部標準として用いた。水系溶媒の基準物質は他にも数種類があり、それらの値によってケミカルシフトが変わるので、過去のデータと照らし合わせる際には換算する必要がある場合がある。ぶんせきの友、「水系溶媒のケミカルシフト基準物質」のページに値を載せてある。
Peak List Date: 1.08.2000 Time: 9:57 File Name: f:\xwin_nmr\piccsuc\1\pdata\1\1R Peak Results saved in File: - Peak Picking Parameter: Peak constant PC: 1.00 Noise: 20890 Sens. level: 83559 Peak Picking region: Start(ppm) Start(Hz) End(ppm) End(Hz) MI(%) MAXI(%) 5.57 2784.0 3.27 1633.7 2.96 56.33 Peak Picking results: Nr. Data PointFrequency PPM Intensity %Int. 1 17819 2711.39 5.4214 58599220 30.8 2 17835 2707.45 5.4135 56228112 29.6 3 20242 2115.07 4.2290 58743120 30.9 4 20277 2106.45 4.2118 73288184 38.5 5 20561 2036.56 4.0721 32324242 17.0 6 20596 2027.94 4.0548 60631412 31.9 7 20631 2019.33 4.0376 31666050 16.6 8 20885 1956.82 3.9126 15806547 8.3 9 20900 1953.13 3.9052 19777648 10.4 10 20909 1950.91 3.9008 26656552 14.0 11 20925 1946.97 3.8929 25951196 13.6 12 20933 1945.00 3.8890 18419492 9.7 13 20943 1942.54 3.8841 20945610 11.0 14 20959 1938.61 3.8762 21217898 11.2 15 20983 1932.70 3.8644 16209837 8.5 16 20996 1929.50 3.8580 30285644 15.9 17 21009 1926.30 3.8516 23874572 12.5 18 21023 1922.85 3.8447 23362496 12.3 19 21039 1918.92 3.8368 38684452 20.3 20 21057 1914.49 3.8280 137842064 72.5 21 21070 1911.29 3.8216 165449808 87.0 22 21082 1908.33 3.8157 109989384 57.8 23 21148 1892.09 3.7832 28475798 15.0 24 21188 1882.25 3.7635 53714780 28.2 25 21226 1872.89 3.7448 37047912 19.5 26 21359 1840.16 3.6794 190243232 100.0 27 21569 1788.48 3.5760 38174412 20.1 28 21585 1784.54 3.5682 36138540 19.0 29 21610 1778.39 3.5559 31105444 16.4 30 21625 1774.70 3.5485 29512232 15.5 31 21738 1746.89 3.4929 33900840 17.8 32 21777 1737.29 3.4737 53534280 28.1 33 21815 1727.94 3.4550 26059848 13.7
sucroseには還元末端が無いため、1H-NMRスペクトルは糖2個分のシグナルのみが現れる。還元糖の場合、還元末端の糖の各アノマー由来のシグナルが存在比に応じた強度で現れる。両アノマー間で還元末端でない糖残基由来のシグナルも異なれば糖4個分のシグナルがあらわれ、スペクトルは大変複雑になる。
ここで注目すべきシグナルは、アノメリックプロトンである。sucroseの場合、glucoseのアノメリックプロトン(δ 5.42ppm)の一個所で、2位とのカップリング定数(4Hz)から結合様式がαであることがわかる。
糖の場合、DEPTを測定してメチル、メチレン、メチン、4級カーボンを区別しなくとも容易に解析できる。DEPTも含め、13C-NMRは現在のところ最も時間のかかる測定なので、これらが容易に判断できる場合はDEPTは測定しない。
Peak List Date: 1.08.2000 Time: 11:12 File Name: f:\xwin_nmr\piccsuc\2\pdata\1\1R Peak Results saved in File: - Peak Picking Parameter: Peak constant PC: 1.00 Noise: 6207423 Sens. level: 24829690 Peak Picking region: Start(ppm) Start(Hz) End(ppm) End(Hz) MI(%) MAXI(%) 117.16 14733.9 53.95 6785.1 -9.20 135.23 Peak Picking results: Nr. Data Point Frequency PPM Intensity %Int. 1 17056 13394.16 106.5079 321171904 73.4 2 18479 11946.61 94.9973 422521568 96.6 3 19815 10587.56 84.1903 401305216 91.8 4 20428 9963.99 79.2318 307364928 70.3 5 20726 9660.84 76.8213 341605920 78.1 6 20903 9480.79 75.3895 397089376 90.8 7 20924 9459.43 75.2196 390768064 89.4 8 21088 9292.60 73.8930 437329920 100.0 9 21317 9059.65 72.0407 370932416 84.8 10 22164 8198.03 65.1893 407757472 93.2 11 22290 8069.86 64.1701 313456352 71.7 12 22442 7915.24 62.9405 317328864 72.6
まず、1H-NMRではっきりしているglucose 1位のプロトンからCOSYスペクトルの相関を辿っていく。5位のメチンプロトンと6位のメチレンプロトンの3個分がほぼ同じ位置に重なっているように見え、このことは後のHMQCによって確認できる。
fructoseの1位は孤立メチレンであり、スピン系がつながっているのは、3位から6位までである。3位から6位までのうち3位が4位とのカップリングのみによってダブレットとなることから、これをδH 4.22 ppmのシグナルと帰属できる。fructoseのCOSYの解析はここからはじめ、6位までの相関を辿ることができる。
のこった孤立メチレンがfructose 1位である。化合物中3組のメチレンプロトンは、すべて偶々ほぼ等価に現れている。
COSYですべてのプロトンが帰属できているので、それに直接結合するカーボンが帰属できる。4級炭素が一本残り、これがfructose2位炭素で, そのケミカルシフトからフラノース構造をとっていいることがわかる。
すべての糖残基のシグナルの帰属ができたので、それを縦、横に添えてある1Dスペクトルに書いておく。また、直接結合するプロトンとカーボンに由来するダブレットに印をつけておく。
次に、二つの糖がどのように結合しているかを調べる。HMBCスペクトルでは2本または3本の結合を介したカーボンとプロトンを検出することができるので、グリコシド結合を介したプロトンとカーボンにも相関が現れるはずである。実際、糖残基間で相関ピークを与えているのは glucose の1位のプロトンとfructose 2位のカーボンであるから、Ｇ1→2Ｆのつながりが明らかになる。また、fructose 2位のカーボンは1位の孤立メチレンのプロトンと相関を与えこの帰属が確認できる。
以上をまとめてテーブルを作る。
ここでは二糖を取り上げたが、基本はすべてのオリゴ糖に共通である。