DNA分離２（マイクロサテライト解析用）

NaOH 法による Phytophthora infestans の DNA 分離

菌体の凍結乾燥

１．供試菌株をグリンピース液体培地で培養する（20℃～室温で可、１菌株あたりシャーレ１枚／およそ１週間）

２．培養菌体をピンセットで回収し、ろ紙で液体培地を吸収除去する／菌体を1.5ml チューブに入れ（丸まらないように広げて）、パラフィルムでチューブ開口部を半分だけ塞ぐ（空気が抜けるが菌体が飛散しないように）

３．－80℃で30分以上凍結する（このままで保存可能）

４．凍結乾燥機を用いて完全に乾燥する（装置の説明書に従う）

５．チューブのパラフィルムを除去し、ふたを閉める（このまま室温で長期保存可能）

• ※ この操作で菌体はパリパリの紙のような状態になる／菌体の長期保存を必要としない場合は液体培養菌体をそのまま「DNA分離」に供することも可能

DNAの分離

（あらかじめサンプル数分の 1.5ml チューブに90µl の100mM Tris-HCl pH8を入れておく）

１．ペッスル先端で海砂を少量とり、丸底トレフ1.5ml チューブに入れる

２．ペッスル先端で供試菌株の凍結乾燥菌体を少量とり、丸底1.5ml チューブに入れる

３．菌体をペッスル（チューブの形状に合ったもの）で５- 10回ほど破砕する

４．破砕作業中のチューブに30µl の 0.05N NaOH を加える

５．菌体をペッスルで５- 10回ほど破砕する

（次のサンプルを処理する）（全サンプルの処理が終わったら）

６．チューブを 12,000rpmで５分間遠心する

７．各チューブから10µl の上清をとり、90µl の100mM Tris-HCl pH8を入れたチューブに加える

８．PCR 用テンプレート（－20℃保存、PCR 時にはこの1 µl を使用）