DNA分離１（フィンガープリント用）

Phytophthora 細胞からの total DNA の分離

○試薬
抽出 buffer　 (100mM Tris-HCl pH 8.0; 50mM EDTA; 100mM NaCl;
10mM β-mercaptoethanol; 1% SDS)　用時調製、保存不可
1M Tris-HCl (pH 8.0) 1ml
0.5M EDTA 1ml
3M NaCl 0.33ml
β-mercaptoethanol 7μl
10% SDS 1ml
MQ で10ml とする／室温保存
RNase A 溶液 (RNase A 10mg/ml)
10mg RNase A (SIGMA) を 1ml 沈殿溶解緩衝液に溶かし、沸騰水中で15分間加温 し室温に戻す。-20℃保存。使用時には100倍に希釈する。
Proteinase K 溶液（Proteinase K 10mg/ml TE)
フェノール／クロロホルム ／イソアミルアルコール
TE飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（50：50：1）
クロロホルム
3M 酢酸ナトリウム溶液 (pH 5.6)
100% エタノール
75% エタノール
TE (10mM Tris-Hcl pH8.0 ; 1mM EDTA)
1M Tris-HCl (pH 8.0) 10ml
0.5M EDTA(pH 8.0) 2ml
ＭＱで 1000ml とする／４℃保存

○操作

１菌株あたりシャーレ15〜20枚（RyeA 液体培地）を用いて培養する
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培養菌体（湿重 ２〜４g）をブフナー漏斗で集め、秤量する（-80℃で保存可能）；液体窒素中、乳鉢で破砕する（疫病菌 10分・多核Rhizoctonia は 15分以上/）
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破砕した菌体粉末を融解しないうちにオークリッジチューブ内（ほかの入れやすい容器でも可）の 10ml （菌体量により加減する）抽出 buffer に穏やかに懸濁する（少々固まりが残っても問題ない）
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65℃で 10 分間保温する
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12,000 ×ｇ、10分間遠心する；上層を新しいオークリッジチューブに移す（８〜９ml、デカンテーション）
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1/100量のRNase A 溶液を加え、37℃で30分間保温する；1/50量のProteinase K 溶液を追加し、、37℃で15分間保温する（この処理の成否が制限酵素分解の結果に影響する）
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10ml のフェノール／クロロホルム ／イソアミルアルコールを加え、10分間穏やかに反転混合する（１）（フェノールが漏れないようポリ袋で包んで操作する）
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12,000 ×ｇ、10分間遠心する（変性タンパク質の中層が見える）；上層を新しいオークリッジチューブに移す（８〜９ml、先を切ったブルーチップを使用）（１）
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10ml のフェノール／クロロホルム ／イソアミルアルコールを加え、10分間穏やかに反転混合する（２）（フェノールが漏れないようポリ袋で包んで操作する）
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12,000 ×ｇ、10分間遠心する（変性タンパク質の中層は見えなくなる）；上層を新しいオークリッジチューブに移す（８〜９ml、先を切ったブルーチップを使用）（２）
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12,000 ×ｇ、10分間遠心する；上層を 50ml 乾熱済みビーカーに移す（８〜９ml、先を切ったブルーチップを使用）；液量を正確に測定すること
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DNA 溶液の 1/10 量の 3M 酢酸ナトリウム溶液を加え、穏やかに混合する
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DNA 溶液の 2.5 倍量の 100% エタノールを層になるように静かに加え、１分間静置する：火炎滅菌して冷却したガラス棒で DNA を巻きとる（巻き取れない場合は中止する）
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巻きとった DNA 繊維をガラス棒ごと 75% エタノールに浸漬し、３分間静置する
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DNA 繊維のついたガラス棒を逆さまにして空気中に立て、５分間風乾する
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風乾したDNA 繊維をガラス棒ごと適量（ふつうは１〜２ml、DNA 回収量により加減する）の TE に浸漬し、１〜３日間４℃で静置する（溶解するまで）
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DNA 試料溶液（吸光度測定・アガロースゲル電気泳動によって品質を確認する）