炭素数がおおむね10以上の脂肪酸の混合物は炭素数ごとに分離するのは困難ですので，メチル化してGC-MSで分析するのが一般的です．含量に差が大きくて分析しづらいときは，硝酸銀のTLCで二重結合の数ごとにある程度分離してからGC-MSで測定すると良いでしょう．
低極性のカラムで測定すると，沸点の低い順に出ます．鎖長の短いものから順にほぼ等間隔で，そして同じ鎖長の中では，二重結合の多いものが先に出ます．極性カラムで分析すると，鎖長の短い順に出るのは同じですが，同じ鎖長の中では，不飽和の多いものが後に出ます．極性のキャピラリカラムでは，二重結合の位置の違いを分離して得ることもできます．
エーテルに含まれていた抗酸化剤のBHT(butylhydroxytoluene, 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxytoluene)が出ることがあります．
天然の脂肪酸は，アセチルCoAで伸長するので，炭素数が偶数のものが多いため，内部標準には奇数の脂肪酸，例えば炭素数17の飽和脂肪酸が選ばれることがあります（最初に，これが入っていないことを確認してから)．
飽和の場合，基準ピークはm/z 74，87, 101, 115, 129...... M-43, M-29, M+のようなパターンになります．不飽和がある場合は基準ピークは構造によって41か55か67など，M+の強度が弱く，M-32が見えることがあります．GCでの間隔とMSのパターンが合わないときは，分岐あるいはシクロプロパン環のある脂肪酸かも知れません．
メチルエステルのMSスペクトルのフラグメントイオンは，ほぼ開裂したカルボニルを含む側が出ます．しかし強度が弱くて二重結合の位置まではわかりにくいことが多いです．そのような時はピロリジル誘導体にするとフラグメントイオンが強めに出て読みやすくなります（続実験性化学講座3上)．
また，ジメチルジスルフィド付加体とすると，二重結合のあった位置で開裂したフラグメントイオンが，そうでないフラグメントイオンよりもはっきり出ます(Anal,Chem., 55, 818-822(1983), J. Cromatogr．219, 379-384, 1981)．二重結合が複数ある場合でも使えます．
たとえば、脂肪酸のメチルエステルモノエンフラクションをDMDS化して、微極性カラムで測定したトータルイオンカレントクロマトグラムは下図の様になります。中極性カラムで、たとえば230度から、1℃/min昇温などでも同様に分析できます。
ピークa,bはM+ 376, c,dは390が得られ、元の脂肪酸がそれぞれC17:1、C18:1であったとわかります。ピークaのMSスペクトルには、分子イオンのほか、215, 161,129が得られています。二重結合の位置は下図の様になります。左側のフラグメントイオンからはさらに、脂肪酸のメチルエステルでも見られる、脱メタノールのフラグメントイオンが得られています。
同様に、ピークb, d も解析できます。ピークcはイオンが多く得られていますが、詳細に解析すれば二つの成分が重なっているのがわかります。
(メチル化していない)脂肪酸を表現するのに，鎖長：二重結合の数 としてあらわすことがあります．これに続いて括弧内に二重結合の位置を表すこともあります．鎖長はカルボニルも入れて数え，ナンバリングはカルボニル炭素が1位です．α位，β位，γ位などというのは，カルボキシル基の結合している炭素から数えるので，それぞれ，2位，3位，4位のことです．不飽和脂肪酸は酵素的に二重結合が導入され，メチルから数えて同じ位置に二重結合があるものが多い．複数の二重結合があるときは，最初の二重結合の数字でω-3あるいはn-3のように表します．
脂肪酸には慣用名のついているものが多く，使われる頻度も高いです．また，トリグリセリドの構成脂肪酸を表すのにも慣用名由来の略号が使われることがあります．
脂肪酸の慣用名とそのメチルエステルの質量数早見表．
The Lipid Libraryいろいろな脂肪酸誘導体について分析法、各種スペクトルが載っているサイトです。