ヘテロプラズミーかな？と思ったときに読んで欲しい話

はじめに

ミトコンドリアは独自のDNAを保持しており，それが生物学の研究によく使われている．研究者はしばしば「異なるミトコンドリアDNA」という記述をするが，これは塩基配列が異なるミトコンドリアDNAという意味である．例えば，2つのミトコンドリアDNAの塩基配列を比較して1塩基の違いを見つけたときでも，それらを区別することに意味があるのなら「異なるミトコンドリアDNA」という．2つの異なるミトコンドリアDNA（あるいは色素体DNA）が1個体内に共存することをヘテロプラズミー（heteroplasmy）という．1つの細胞の中から2種類のミトコンドリアDNAが見つかるような状態，とイメージしてもらえば良いと思う．ヘテロプラズミーは動物，植物，あるいは菌類など，様々な真核生物から発見されており，普遍の現象と考えられている．遺伝学の教科書に沿うと，ヘテロプラズミーは理解しがたい現象である．なぜならミトコンドリアDNAは母性遺伝なので両親のミトコンドリアDNAが混じり合うことはない．何かのはずみで2種類のミトコンドリアDNAが一つの細胞に混在することになっても，細胞分裂を繰り返すと片方のミトコンドリアDNAを失った細胞が出現するはずである（体細胞分離）．それ故，ヘテロプラズミーが生じたり，ヘテロプラズミーを維持する機構を調べるのは面白いテーマの一つである．しかし，研究として進めていくのはなかなか難しい．

ある1個体を解析していて2種類のミトコンドリアDNAが見つかると，ヘテロプラズミーの可能性を考えてもよい．よくあるケースは，大多数のある1種類のミトコンドリアDNAに対して，ごく僅かに別なタイプのミトコンドリアDNAが混じっているように見えることである．実験手法が進歩して極微量のDNA分子が検出できるようになると（例，サザンハイブリダイゼーション→PCR→次世代シーケンス解析という進歩），ヘテロプラズミーと思われる事例が次々に見つかるようになった．しかし，こうした研究には落とし穴があるので，注意が必要である．著者らの経験を以下に記す．

著者らは2000年にテンサイミトコンドリアDNAの全塩基配列を発表した．しかし当時採用していた塩基配列決定法は現在のものに比べると精度が劣るので，今となっては発表したデータに不満がある．加えて，解析に用いたテンサイ系統はとても古いものなので，現在育種に使われているような系統のデータがあれば何かと便利ではないかと考えた．そこで，テンサイミトコンドリアDNA塩基配列の再解析を行うことにした．　

日本のテンサイ（Beta vulgaris）系統のミトコンドリアDNAは，まず大きく正常細胞質とOwen細胞質の2種類に分けられる．正常細胞質はさらに2種類に細かく分けられることがわかっているが，遺伝子の配置などの大まかな構造に違いはない．そこで，2000年に発表したミトコンドリアDNA塩基配列を参照配列（リファレンス）とし，育種で使われているテンサイ系統から新たに得た次世代シーケンス解析のリードを並べていくことにした．いわゆるリシーケンスである．植物ミトコンドリアゲノムのサイズは動物よりも大きく，テンサイ正常細胞質で約36万8000塩基対（368 kbp）であるから，初心者にはそれなりに労力を要する実験である．得られたデータを見ていると，奇妙なことに気がついた．2種類の塩基を持つサイトが非常に多いのである．すなわち，あるサイトに注目したときにアデニン（A）のリードもあればグアニン（G）のリードもある．別なサイトでは塩基の有無の違いも見つかった（indel）．このようなサイトはミトコンドリアDNA全体に分布し，いくらでも見つかる．これらは全てヘテロプラズミーなのだろうか？

核DNAにはミトコンドリアDNAとの相同配列が存在する

ミトコンドリアDNAはミトコンドリア独自のものであるが，その一部分と同じ塩基配列が核DNAから見つかることがある．これをnuclear mitochondrial DNA segment（もしくはsequence）に基づきNUMTという．NUMTはミトコンドリアDNAの一部が核DNAにコピーされたり，その逆が起こることで生ずる（より正確にはミトコンドリアDNAの一部が核に移行したり，その逆が起こる）．NUMTは核DNAの中にあるので，ミトコンドリアDNAとは無関係に変異を蓄積することができる．そうなると，1細胞中で互いによく似ているが少し違いのある塩基配列をミトコンドリアDNAと核DNAがそれぞれ持つことになる．このような試料を用いて次世代シーケンス解析を行ってみよう．次世代シーケンス解析ではあるリードがミトコンドリアDNAに由来するのか核DNAに由来するのかを知ることはできない．そのため，ミトコンドリアDNA塩基配列をリファレンスにすると，ミトコンドリアDNA由来のリードに加えてNUMT（すなわち核DNA）由来のリードも載ってしまう．そうなれば，ミトコンドリアDNAとNUMTの塩基配列の違いがあたかもヘテロプラズミーであるかのようにみえる結果をもたらすだろう．

まずはNUMTの影響を取り除く必要がある．テンサイの核DNAについてはアメリカの系統を使ったよいリファレンスが構築されている．そこで，現在のミトコンドリアDNAのリファレンスを精査し，アメリカの系統の核DNAリファレンスに相同配列があればその塩基配列を取り除いていった．NUMT以外にもヘテロプラズミーと見誤る結果をもたらす要因として色素体DNAとの相同配列やミトコンドリアDNA上で繰り返し現れる塩基配列が考えられるので，これらも同時に取り除いていった．一連の操作により実に7割以上の塩基配列が削除された．残った塩基配列はミトコンドリアDNAに固有なシングルコピーの塩基配列なはずである．

NUMTの系統間多型をヘテロプラズミーと見誤る

残った塩基配列は9万7000塩基対ほどであった．それでも1000か所ほど2種類の塩基を持つ（ヘテロプラズミーのようにみえる）サイトが含まれている．その一部である12サイトについて詳しく調べてみた．これら12サイトはおよそ300塩基対の領域に含まれるので，これを300-bp領域とする．著者らは2系統を供試したのだが，いずれからもミトコンドリアDNAリファレンスと同一な300-bp領域に加えてそれとはわずかに塩基配列の異なる300-bp領域が見つかる．すなわち供試した日本のテンサイ系統は2種類の300-bp領域をもつのである．300-bp領域はアメリカのテンサイ系統の核DNAに相同配列は見つからないのはもちろん，ドイツの系統を使って発表された核DNA配列からも見つからない．ところが，それらとは別な系統の核DNAから300-bp領域が見つかったのである．加えてテンサイと同じB. vulgarisに属するフダンソウのある系統の核DNAからも300-bp領域が見つかった．これらのことから，最初にリファレンスにしたアメリカの系統は300-bp領域に相当するNUMTを持たないが，その他のテンサイ系統の核DNA中には300-bp領域がNUMTとして存在する場合があると考えられた．そこで，供試した日本の系統に該当するNUMTがあるかどうか調査した．供試した2系統を比較すると，わずかに混入している300-bp領域が互いに異なっていることがわかった．そこでこれらの系統を交配して得られたF1を自殖し，F2集団を育成した．もし混入している300-bp領域が核DNAに由来するのであれば，そのF2集団においてメンデル遺伝に従う遺伝分離が見られるはずである．実験の結果，いずれかの系統と同一の300-bp領域を持つ個体に加え，ヘテロ接合のようにみえる個体が得られた．母親型ホモ接合，ヘテロ接合，および父親型ホモ接合の個体数は理論分離比1:2:1に適合した．しかもテンサイの緑葉においてミトコンドリアDNAと核DNAのコピー数の比率はおよそ40:1から60:1であるが，混入している300-bp領域も試料中でこのくらいの存在比である．そうなるとこの300-bp領域はNUMTであることが極めて濃厚で，この領域についてはこれ以上の調査を中止した．

以上の結果から，ある教訓を得ることができた．すなわち，NUMTの系統間多型は考えられているよりもずっと多い．この点を明示して注意を喚起している研究論文は，少なくとも植物分野ではこれまでほとんどなかったと著者は思っている．これを踏まえて過去の研究論文を振り返ってみると，まずNUMTの可能性を考慮せずにヘテロプラズミーを論じているものはその結論を直ちに信ずることはできない．また供試材料が遺伝的に多様なのに，ここで紹介した方法と同様に一つの核DNAリファレンスに依拠してNUMTの可能性を除いたと主張するものも同様である．あるいはモデル植物の標準系統といわれるものであっても，ロットによってNUMTが異なる可能性もあるのではないだろうか？そのような疑念を抱かせるほど，著者にとってはショックであった．

一方，著者らはヘテロプラズミーそのものは否定しない．実際，著者らは明らかにメンデル遺伝ではない挙動を示すサイトを見つけている．ただし，そうした真のヘテロプラズミーは数多あるNUMTの中に埋もれているのではないだろうか．この経験を通じてヘテロプラズミーの研究に大きな困難が伴うことを実感した．以上の内容を含む論文を発表したので，詳しく知りたい方はこちらを御覧ください．

2023年8月29日